手机支付宝合买彩票:蛋白質晶體結構與藥物發現(5)

蛋白質晶體結構與藥物發現(5)

蛋白質晶體數據的收集:

蛋白質晶體平均含有50%的溶劑,如果暴露于空氣中,它們會干燥并分解。此外,當在室溫下暴露于高強度X射線時,由于輻射損傷,它們會非??燜俚厥パ萇淠芰?。為了延長晶體使用壽命和改善數據質量,X射線測量現在通常在80-110 K下進行。晶體首先安裝在10-20微米尼龍環上,然后浸入液氮中快速冷凍。為了防止形成冰晶,通常有必要向周圍的母液中加入冷凍?;ぜ寥綹視?,低分子量聚乙二醇或高鹽。

為了收集數據,首先將將晶體置于角度計上,該儀器控制X射線束下的晶體旋轉,于此同時向晶體吹干燥氮氣使溫度保持在80-110K(如上圖所示)。對衍射效果較好的晶體可以使用旋轉陽極X射線發生器測量,但對于衍射效果不好的晶體,需要使用同步輻射源,例如瑞士的Swiss Light Source(SLS)或法國的同步輻射裝置(ESRF)等。在數據收集過程中,晶體慢慢旋轉,使所有反射面都進入衍射狀態。

衍射斑點通常記錄在CCD檢測器或基于成像板的檢測器上。對高質量晶體而言,收集高質量X射線數據集的時間只需要幾分鐘。而對于弱衍射晶體,從高強度同步輻射源下,收集高質量的數據需要幾天到幾周的時間。探測器的衍射圖像(如下圖所示)直接輸入計算機,產生一系列反射強度。每個晶體將會記錄數千到數十萬個反射,這取決于晶體的質量和晶胞的大小。

X射線對晶體的衍射:

光學顯微鏡和X射線晶體學具有相同的基本原理。光學顯微鏡使我們能夠詳細研究昆蟲或細胞切片等小樣本,但物理上不可能發現任何小于所用光波長一半的微小物質。為了解析大約1-5?(0.1-0.5 nm)的細小原子結構,需要比波長更短的電磁波例如X射線。光學顯微鏡和X射線裝置具有相同的基本原理,但由于X射線和可見光的不同性質,實際實施方式有很大不同。

在光學顯微鏡中,光線照射在樣品上,并散射到各個方向。使用一組透鏡重組散射光重建原始樣本的放大圖像。在X射線實驗中,來自X射線源的X射線擊中了晶體,并在各個方向上散射,就像光學顯微鏡一樣。遺憾的是,不能制造能夠將散射的X射線聚焦以重建樣本的放大圖像的透鏡。 所有晶體學家可以做的就是直接記錄散射的X射線,并使用計算機程序重建樣品的放大圖像。

晶體結構中出現嚴重錯誤是非常罕見的,通常嚴重錯誤出現在新靶標結構的首次測定中,尤其是在只有低分辨率數據(3.0-5.0?)可用時。但是,晶體結構中的小錯誤和結構的不準確性是非常普遍的,而且幾乎是不可避免的。這些晶體結構中錯誤的往往被忽視,晶體結構的小細節往往被非晶體學家過度解釋。所以晶體結構的使用者應該清楚晶體結構的局限性。

影響蛋白質模型的因素:

大分子結晶學中的一個主要誤差來源是,由于分辨率有限且觀察比率參數不合適,因此我們無法適當地檢測和模擬“無序”。模型的建模過程通常試圖將源自幾個不同但重疊的構象狀態的模糊電子密度圖模擬成單個模型。這可能導致幾何變形。

第二個重要的誤差來源是,即氫原子不能被檢測到,并且在大多數蛋白質晶體通??紗锏降姆直媛剩?.5-3.0?)中原子類型不能被確定。這導致某些基團的確切取向含糊不清,例如Asn和Gln殘基的側鏈酰胺或組氨酸側鏈的咪唑環。

影響配體錯誤的因素:

同樣,多個配體基團的確切取向無法精確測定。對非標準基團,進行精確的幾何約束是潛在的錯誤來源。例如,帶有一個芳族取代基的叔胺的氮原子通常是平面的,但它也可以是金字塔形的。 在高分辨率下(優于2.0?),可以根據電子密度選擇合適的幾何約束。 在較低的分辨率下,模型無法具有精確的幾何形狀。

柔性和溫度因子:

蛋白質是柔性分子,在晶體狀態時,具有相當程度的柔性。在使用實驗數據擬合得到的模型中,原子在晶體中的移動性用溫度因子或B因子(B-factor)表示。上圖給出了平均總位移與B因子之間的關系。 原子的B因子超過60?時,其平均位移往往大于1.5?,這是碳 -碳鍵的長度。這些原子通常在電子密度圖(如下圖所示)中定義不明確,盡管在靜態無序的情況下,并且電子密度很弱,這些原子仍然可以很好地定義。在分析的過程中,應該記住,這些柔性表面殘基應當要么被置于任意的低能量構象中,要么從坐標文件中刪除。不考慮這一點將會導致嚴重的錯誤,尤其是在靜電計算的過程中。

以位于人凝血酶表面的Lys87為例(如上圖所示),暴露于溶劑的長鏈和柔性側鏈(如精氨酸,賴氨酸,谷氨酸和谷氨酰胺)常常自由移動。這些側鏈具有非常高的溫度因子,并且在電子密度圖中非常差或根本未定義。 應該考慮到許多這樣的表面殘基不具有明確定義的取向,這樣的殘基應該在文件中刪除,或者置于任意的低能構象中。

蛋白質晶體結構中的假陽性和假陰性:

毫不夸張的講,蛋白質晶體學實驗中一般不會出現假陽性。 然而,就結合配體而言,對一些模糊的電子密度特征的誤解將導致假陽性的發生。這種錯誤的例子非常罕見。在基于片段的篩?。‵BS)過程中,將不太明確的電子密度斑點分配給混合物中存在的化合物,有時會造成極大的困擾。這個問題可能由于分辨率或X射線數據質量不足,多重疊結合模式的存在,或幾個化合物或緩沖液組分競爭性結合到同一位點而導致。配體識別和自動擬合程序是非常有用的,但經驗豐富的科學家對結果的仔細評估仍然至關重要。 在模棱兩可的情況下,設置多個實驗組。包括控制組(不包括假定結合化合物的混合物),假定結合組(僅僅包括假定結合化合物)。

與假陽性相比,假陰性的出現在蛋白質晶體學中相對頻繁,特別是處理低親和力化合物時。因此,在X射線實驗中未能觀察到結合不一定是化合物不能成為真正的配體。研究人員應使用質譜,表面等離子體共振和微量熱法,以避免太多不確定的X射線實驗。

原則上,在共結晶實驗中,高濃度的蛋白質和配體非常有利于弱結合分子-蛋白復合物的研究。然而,晶體中的蛋白-蛋白接觸可以阻止進入配體結合位點(在浸泡實驗中)或擠出配體(在共結晶實驗中)。 此外,復合物的形成可能受結晶條件(pH值,高鹽或高濃度甘油,低分子量聚(乙二醇)或有機溶劑)的不利影響。 另外,在結晶條件下,某些化合物的溶解度可能非常低。

參考文獻:Chapter 30 Protein Crystallography and Drug Discovery. In?The Practice of Medicinal Chemistry, 3rd Ed, 2008